Para a maioria das descobertas de anticorpos, esforços significativos foram despendidos na clonagem de…

Question

Para a maioria das descobertas de anticorpos, esforços significativos foram despendidos na clonagem de células para identificar células B isoladas pareadas às sequências de anticorpos que elas produzem. Essas sequências são importantes, pois foram selecionadas pelo sistema imunológico como ligantes biologicamente relevantes, proporcionando proteção contra patógenos durante a infecção. No entanto, as sequências de cadeia pesada (VH) e leve (VL) vêm de diferentes transcritos de mRNA, e, se culturas mistas de células B forem lisadas para capturar as sequências que codificam os anticorpos, o pareamento original do anticorpo é perdido e ele não se ligará mais ao alvo pretendido.

Resumidamente, segundo Keating e Higgins (2024), como as novas técnicas de produção de anticorpos terapêuticos recombinantes superaram esse problema?

Accepted Answer

Usando citometria de fluxo ou encapsulamento de gotículas, células B são isoladas individualmente sendo coencapsuladas com tampão de lise e esferas de poli (dT) magnéticas para posterior amplificação das regiões VH e VL e geração de fragmentos variáveis de cadeia única (scFv) pareados nativamente.

Answer

Por meio da amplificação das regiões VH e VL por PCR de um lisado total de DNA genômico ou cDNA originados de células B isoladas, sendo os amplicons gerados clonados diretamente em vetor plasmidial para posterior expressão.

Answer

Utilizando mRNA total extraído do sangue de pacientes vacinados ou convalescentes, é possível gerar cDNA a partir desse material para posterior amplificação das regiões VH e VL por PCR para geração de bibliotecas de fragmentos variáveis de cadeia única (scFv) e posterior expressão em fagos.

Answer

O isolamento é realizado em placas de 96 poços, onde as células B são cultivadas em grupos, seguido de amplificação por PCR específica da região Fc e clonagem em vetor para sequenciamento.

Answer

Por meio do uso de ferramentas de predição de epítopos por bioinformática, associada a métodos de isolamento em placa e imunoensaios utilizando peptídeos ligados a membranas.

Questão de FarmáciaAnálises Clínicas, Biologia Molecular e Biotecnologia

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